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技术测评——外泌体研究有哪种方法可能取代超速离心?

2019/10/18

        细数近几年的研究热点,最火爆的莫过于外泌体。外泌体相关国自然基金支持力度也逐年上涨,2019年更是达到了2.54亿元,较去年增长44.5%(图1)。

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图1 历年国自然支持的外泌体研究基金

         外泌体分离是外泌体研究的第一步,也是至关重要的一步。只有得到高纯度有活性的外泌体,才能在下游功能和内容物分析中获得准确数据。然而,目前国际上还没有特别完美的分离方法。         
         两步超速离心(UC)分离法(图2),是由法国居里研究院的Théry博士提出的,利用外泌体的理化性质分离外泌体的技术,该方法是目前最为经典的外泌体分离方法,也是文献报道最多的分离方法。

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图2 超速离心法提取外泌体的实验流程示意图 
(Théry, C. et al. Curr Protoc Cell Biol ,2006)

        然而,UC分离方法过程繁琐、耗时耗力。同时,UC分离方法,对操作人员经验依赖性很强(相信很多人都有使用UC的痛苦回忆),导致实验结果重复性很差。诸多因素限制了UC方法在外泌体生产和临床上的应用。除此之外,UC方法从技术原理上还有一些更为致命的缺点,让我们通过技术文献的报道进行全面了解:


UC缺陷一:外泌体回收率低

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       为了验证UC分离外泌体的效率,研究人员将收集沉淀后的上清继续UC,如是四次,每次离心力为120,000 xg,离心时间为1h。经Western blot检测,在重复UC后的沉淀中,CD63和TSG101的检测值基本相同,并无下降趋势(红色方框)。说明超离后的上清中仍含有大量外泌体,揭示了UC方法分离外泌体效率低,回收率低的问题。


UC缺陷二:引起外泌体聚集并破坏其完整性       

        越来越多的证据表明,超高的速度离心会对外泌体的完整性产生负面影响:UC可能导致样本中外泌体与其他非晶颗粒的聚集和共沉淀,甚至导致外泌体的破裂或与污染物以及其他蛋白质融合,影响外泌体的物理性质和下游分析。

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  免疫电镜下,观测到免疫胶体金标记(CD41)的超离后得到的外泌体发生聚集现象。
右图为左图白色方框放大后的景象,大量具有典型茶托状结构的外泌体聚集在一起。


UC缺陷三:无法有效去除高峰度脂蛋白

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       研究人员对滑膜液经过相同的预处理后,分别使用超离(UC)、密度梯度离心(DGC)和尺寸排阻进行外泌体的分离。并通过WB、TEM对其进行鉴定分析。发现通过等蛋白质量的WB成像后,UC和DGC分离的外泌体的HDL标志物 apoa-1以及血清白蛋白(albumin)的条带清晰可见,说明这两种方法无法去除HDL和血清白蛋白。电镜图像显示,超离后的背景较差,且发生外泌体与小颗粒非晶物质的聚集(红色圆圈)。UC无法有效去除脂蛋白,对于下游的蛋白组学质谱实验将是灾难。      
         所以,亟需一种新的方法帮助外泌体科研人员走出困境。经过华盈生物的长期探索,终于在查阅大量文献和研发摸索后,找到了这种方法——尺寸排阻色谱法(Size-exclusion chromatography,SEC)。
        SEC是将具有特定孔径的多孔聚合物填充在分离柱中。当含有外泌体的样本在重力作用下流经填充物时,粒径小于微球孔径的物质会进入到孔隙之中,被暂时捕获。而大于孔径的物质(如外泌体)则不会进入孔隙,更快的被洗脱出来,从而实现外泌体的分离纯化。



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        根据ISEV(国际胞外囊泡协会)开发的数据库EV-TRACK统计,2017年,使用基于SEC方法分离外泌体的文章数量位居第二,仅次于超离。

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(Marta Monguió-Tortajada , et al. CMLS, 2019)

       可见SEC方法已经得到越来越广泛的认可。那么是什么原因,让这种方法获得如此高关注呢?下面我们通过文献和数据对比,向大家一一呈现。


SEC优势一:杂蛋白去除率高,纯度高

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        研究人员对比了SEC和UC分离外泌体的纯度,使用ELISA试剂盒分析了分离后的外泌体中铁蛋白复合物的污染情况,发现SEC与UC相比,该蛋白的丰度降低了100倍。经过进一步的蛋白组学分析,发现两种方法都能够很好的匹配外泌体相关蛋白,但是UC制备外泌体中含有大量独特的图谱蛋白。表明SEC分离的外泌体具有更高的纯度。


SEC优势二:外泌体结构完整,功能活性高

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        该实验基于CPC(心肌祖细胞)衍生的外泌体通过诱导ERK磷酸化,激活 MAPK1/2-ERK1/2通路,进而刺激人微血管内皮细胞(HMECs)迁移,这样一个前提。研究人员分别使用UC和SEC分离CPC培养上清中的外泌体,刺激HMECs,通过比较外泌体刺激后的pERK / ERK,分析两种方法所得外泌体在功能活性上的差异。       
        在之后的实验中,实验人员先是分析了相同总蛋白质量下的Western Blot结果,通过对比,SEC制备外泌体的pERK / ERK比UC更高,两个蛋白质量下的两次重复结果相同。但是考虑到可能SEC方法制备的外泌体纯度更高,相同蛋白质量内含有的外泌体更多,从而pERK/ERK更大。于是研究人员又进行了相同总粒子数下的pERK/ERK对比,结果相同。表明SEC制备外泌体具有更高的活性,更适合进行功能学研究。   


SEC优势三:操作简便,耗时短,重复性高

       超离饱受诟病的另一个问题是,UC的重现性差且耗时长,需要操作人员有一定的经验和技巧。相对于超离,SEC的操作则简单很多,只需按要求收集相应组分的溶液,即可获得纯度较高的外泌体,无需掌握特殊技巧,重复性高。而且SEC耗时方面也有明显的优势,只需15~20min即可完成外泌体的分离工作。

UC和SEC操作难度及耗时对比图

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        在2019年刊登于Cellular and Molecular Life Sciences的一篇综述中,作者通过将指标量化打分的形式,来评估目前所有的外泌体分离方法,最终SEC的综合得分最高(28分),在纯度、得率、功能活性、成本以及易用性等方面都优于得分为21分的UC。

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外泌体分离方法对比
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         综上所述,SEC在方方面面都有着取代UC的潜力,有望成为下一个外泌体分离方法的主流,让我们拭目以待!

         那么,问题来了,在哪能够买到SEC呢?

        华盈生物技术人员也是操碎了心,专门从新西兰的IZON公司引进了qEV外泌体分离柱(SEC)系列产品,以满足中国科研人员的多元化需求。        
         根据样品体积和理化性质的不同,qEV共分为5个产品类型,可兼容血浆、血清、胸水、腹水、脑脊液和尿液等多种样本类型。其中qEVoriginal为最常用类型,而qEV100是新上市产品,上样量100mL,可满足体积大浓度低的样本,如细胞培养上清和尿液等。

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        根据下游分析对外泌体纯度和浓度的不同需求,每个类型的分离柱又分为35nm和70nm两种规格,用户可根据自身需求选择。对比图如下:

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        除了分离柱,还有配套的分离柱支架,以及自动组分收集器(AFC),供客户选购。

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        AFC(Automatic Fraction Collector)是IZON自主研发的外泌体自动收集装置,是qEV平台的一项重大改进,实现了自动化智能化分离外泌体。

具有以下优势:

●   高效性:可同时批量处理多个样本。

●   易操作:通过触控屏操作,设定简单易懂,机身轻巧。

●   高精度:精确测量每个液滴的重量。

●   自动化:自动收集外泌体,并通过LED氛围灯实时反馈信息。

       此外,收集到外泌体后,我们不得不对外泌体的质量进行快速评估,这就需要介绍另外一款神器,基于TRPS技术的qNano纳米粒子分析仪。TRPS技术可以在几分钟内完成1例外泌体样品的粒径、粒子数、zeta电位等信息的记录与分析,是SEC下游的理想技术,技术优势横扫目前的NTA技术。

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        关于qNano这款神器的介绍,请听下回分解哦!!

        华盈生物作为新西兰IZON在中国的特约合作伙伴和示范实验室,还可以为您提供基于SEC和TRPS技术的外泌体研究技术服务,协助您用最小的成本体验到SEC和TRPS技术的魅力。 

垂询热线: 021-33938791-8012
QQ: 2120485725 
(本文作者:GP)